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細(xì)胞學(xué)堂 | 微血管內(nèi)皮細(xì)胞知識盤點

更新時間：2023-10-23  |  點擊率：1455


微血管內(nèi)皮細(xì)胞（microvascular endothelial cells,MVECs）構(gòu)成了血液與組織液之間的物理屏障，而且在機(jī)體的凝血與抗凝血、致炎與抗炎及免疫應(yīng)答等方面起著十分重要的作用，其體外培養(yǎng)模型廣泛應(yīng)用于相關(guān)研究。但由于不同組織器官的微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間存在較大的異質(zhì)性，同時微血管內(nèi)皮細(xì)胞因解剖部位不同，在形態(tài)學(xué)、表型和功能上等方面也存在明顯異質(zhì)性，不同來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞之間是不可相互替代的，主要包括腸、肺、心臟、腦、脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜、真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞等。





本期細(xì)胞學(xué)堂為大家整理了微血管內(nèi)皮細(xì)胞的提取、培養(yǎng)和鑒定方法及步驟，幫助您快速上手開展實驗。





提取方法




微血管內(nèi)皮細(xì)胞的提取和培養(yǎng)有酶消化培養(yǎng)法、組織塊培養(yǎng)法、免疫磁珠法。





酶消化培養(yǎng)法

采用消化酶將對應(yīng)組織內(nèi)細(xì)胞間質(zhì)如基質(zhì)、膠原蛋白、纖維蛋白等解離，使細(xì)胞分散，形成單細(xì)胞懸液后再接種進(jìn)行培養(yǎng)的方法。

主要包括：實驗動物及日齡的選擇(根據(jù)取材部位決定動物日齡）→對應(yīng)部位的取材→組織的剪碎及清洗→加酶消化→離心去酶→計數(shù)后接種培養(yǎng)→細(xì)胞純化→細(xì)胞鑒定；



組織塊培養(yǎng)法

是將從體內(nèi)取出的組織剪切成一定大小的組織塊后，接種于培養(yǎng)瓶進(jìn)行的培養(yǎng)。

主要包括：試驗動物及日齡的選擇(根據(jù)取材部位決定動物日齡）→對應(yīng)部位的取材→組織的剪切→接種培養(yǎng)。



免疫磁珠法

通過在磁珠表面包被具免疫反應(yīng)性的抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，篩選或去除所標(biāo)記的細(xì)胞，達(dá)到陽性或陰性選擇細(xì)胞的目的。

主要包括：實驗動物及日齡的選擇(根據(jù)取材部位決定動物日齡）→對應(yīng)部位的取材→組織的剪碎及清洗→加酶消化→離心去酶→加入磁珠與細(xì)胞孵育→磁珠磁力架分選→收集沉淀技計數(shù)→接種培養(yǎng)。




大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞提取示意圖


大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞提取示意圖[1]





各種提取方法的優(yōu)劣勢

酶消化

培養(yǎng)法

可以在短時間內(nèi)得到大量細(xì)胞，但是操作繁瑣，易污染，純化步驟多，需要使用昂貴的膠原酶，導(dǎo)致成本偏高，并且酶濃度和消化時間需要摸索；

組織塊

培養(yǎng)法

成功率較高，成本低，適合于組織量少的原代培養(yǎng)，但是細(xì)胞遷出時間不好把握且組織塊去除不徹-底會造成其它雜細(xì)胞污染；

免疫

磁珠法

得到的細(xì)胞純度高，但是成本高，需要較多的細(xì)胞以備篩選和純化。







注意事項


1

試驗動物的日齡和健康狀態(tài)可能會影響目的細(xì)胞的活性、代次；

2

取材部位的分離需要盡可能多的剔除多余組織以及保證無菌；

3

得到大小適中、容易貼壁的組織塊是分離細(xì)胞的關(guān)鍵；

4

采用吹打法時，吹打管的規(guī)格、吹打的次數(shù)會直接影響細(xì)胞貼壁能力和細(xì)胞的純度；

5

雖然各種酶的消化活力有一定的組織特異性，但由于任一組織器官均不是由單一的組織細(xì)胞成分構(gòu)成，因此酶消化液常根據(jù)所分離培養(yǎng)細(xì)胞的種類等因素進(jìn)行篩選；

6

采用酶消化法時，消化時間和溫度的控制也特別重要。消化時間過長、溫度過高不利于細(xì)胞的貼壁和伸展；消化時間過短、溫度過低則達(dá)不到組織分離的目的；

7

建議使用內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含有內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)所需的微量元素、生長因子等；

8

建議包被處理（比如PLL、明膠等），促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞貼壁，形態(tài)立體；

9

對于大部分細(xì)胞來說，同一種細(xì)胞，大鼠類的細(xì)胞代次會比小鼠細(xì)胞代次略高；


10

隨著傳代的增加，細(xì)胞的形態(tài)會發(fā)生變化。






鑒定指標(biāo)





顯微鏡觀察鑒定


可以初步觀察細(xì)胞形態(tài)和生長規(guī)律，細(xì)胞呈鵝卵石典型的鋪路石樣、多角形、梭形，細(xì)胞核大而清晰；



貼塊法獲取的肺微血管內(nèi)皮，呈鋪路石樣

貼塊法獲取的肺微血管內(nèi)皮，呈鋪路石樣



貼塊法獲取微血管內(nèi)皮細(xì)胞后進(jìn)行消化轉(zhuǎn)瓶，消化轉(zhuǎn)瓶或者傳代后細(xì)胞形態(tài)有變化

貼塊法獲取微血管內(nèi)皮細(xì)胞后進(jìn)行消化轉(zhuǎn)瓶，消化轉(zhuǎn)瓶或者傳代后細(xì)胞形態(tài)有變化





大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞提取過程[2]

大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞提取過程[2]



特異性標(biāo)志


目前使用較多的是FactorⅧ、 vWF、和CD31的陽性表達(dá)。




●參考文獻(xiàn)●

[1]白祥慧，鄒登朗，祁得勝，等. 大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)方法研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)科學(xué)，2021.

[2]張帆. 單篩過濾法體外分離培養(yǎng)原代大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及其鑒定[J].中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2023.

[3]段佳熙，巨噬細(xì)胞外泌體介導(dǎo)慢阻肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究[D].中南大學(xué)，2022.

[4]免疫磁珠法分離培養(yǎng)小鼠原代骨骼肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞及鑒定[J].心臟雜志，2023.

[5]Wong E，Nguyen N，Hellman J.Isolation of primary mouse lung endothelial cells[J].J Vis Exp，2021，（177）：e63625.

[6]Sokol L，Geldhof  V，Garcia-Caballero M，et al.Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues:Small intestine,colon,heart,and liver[J].STAR Protoc，2021,2（2）：100489.