細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是一種簡單且經(jīng)濟(jì)的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法,主要用于評估細(xì)胞在二維空間中的水平遷移能力。它的基本原理是:在細(xì)胞單層上人為制造一道“劃痕",然后觀察細(xì)胞如何遷移以“修復(fù)"這一劃痕,從而判斷細(xì)胞的遷移能力。這一過程不僅與胚胎發(fā)育過程中器官的形成、機(jī)體傷口的愈合過程、免疫應(yīng)答過程等生理過程緊密相關(guān),而且在癌癥研究中尤為關(guān)鍵,因?yàn)榘┘?xì)胞的遷移是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟,這也是實(shí)體瘤患者死亡的主要原因之一[1]。因此,研究細(xì)胞的遷移行為、評估細(xì)胞的遷移能力意義重大。
本期細(xì)胞學(xué)堂將詳細(xì)分析細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢和局限性,并深入探討其基本步驟及注意事項(xiàng),幫助您順利開展實(shí)驗(yàn)。
細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢與局限性
優(yōu)勢
1
能模擬體內(nèi)細(xì)胞遷移過程;
2
保留了細(xì)胞外基質(zhì)和胞間連接;
3
可與活細(xì)胞成像結(jié)合,實(shí)時監(jiān)測細(xì)胞遷移過程;
4
操作簡單、成本低,適合大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室開展。
局限性
1
相較其他幾種常用檢測細(xì)胞遷移的實(shí)驗(yàn),細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞長成單層細(xì)胞和劃痕愈合需要較長時間;
2
細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)常用培養(yǎng)皿、6孔板或12孔板培養(yǎng)細(xì)胞,這導(dǎo)致細(xì)胞和培養(yǎng)基的使用量較大,對于需要使用難以獲取的原代細(xì)胞或昂貴化學(xué)試劑的實(shí)驗(yàn)不適用;
3
在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中無法模擬化學(xué)梯度,無法替代Boyden小室法等其他具有趨化性檢測能力的實(shí)驗(yàn)方法。
實(shí)驗(yàn)步驟
(1)細(xì)胞培養(yǎng)
將細(xì)胞培養(yǎng)成一層緊密相連的單層細(xì)胞(匯合度90%-100%),確保細(xì)胞之間沒有明顯空隙。
(2) 制造“劃痕"
使用移液槍吸頭尖-端在已經(jīng)培養(yǎng)好的細(xì)胞單層上沿直線方向輕輕刮劃,形成人工“傷口",隨后用培養(yǎng)基或PBS清洗掉脫落的細(xì)胞,確保劃痕邊緣平整。
Tips
為了保證在不同時間點(diǎn)進(jìn)行圖像采集時能獲得相同的視野,需事先在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板的底部用極細(xì)的記號筆畫線(如圖1)或使用剃須刀片輕輕蝕刻培養(yǎng)容器底部作為參考點(diǎn)的標(biāo)記。
圖1. 六孔板畫線示意圖
(3)孵育與觀察
將培養(yǎng)器皿放入二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育一段時間(通常為8-48 h,遷移越快的細(xì)胞孵育時間越短),孵育完成后,在顯微鏡下拍攝劃痕區(qū)域的照片。
(4)數(shù)據(jù)分析
通過比較初始劃痕和孵育后劃痕的閉合情況,計(jì)算細(xì)胞的遷移率。遷移率=(初始距離-最終距離)/初始距離或(初始面積-最終面積)/初始面積。
圖2. 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示,暴露于10?μmol/L尼古丁顯著促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移[2]
注意事項(xiàng)
細(xì)胞密度控制
細(xì)胞密度不宜過低或過高。密度過低細(xì)胞難以形成單層膜,導(dǎo)致細(xì)胞間隙過大,細(xì)胞可能會向其他間隙遷移而不向劃痕區(qū)域遷移;密度過大則會導(dǎo)致細(xì)胞在劃痕時成塊、成片被劃落,得不到筆直、平滑的劃痕區(qū)域。
劃痕初始寬度一致
確保每個實(shí)驗(yàn)組和對照組的劃痕寬度一致,避免寬度差異引起的實(shí)驗(yàn)誤差。
孵育時間
根據(jù)細(xì)胞類型和遷移速度,合理設(shè)定孵育時間,確保其在最佳條件下完成劃痕閉合。
邊緣細(xì)胞堆積處理
建議在PBS環(huán)境下進(jìn)行劃痕,并洗滌,可消除劃痕邊緣細(xì)胞堆積的現(xiàn)象[3]。
拍攝位置一致
必須在同一位置進(jìn)行拍攝,保證遷移前后照片的可比性。
增殖抑制處理
實(shí)驗(yàn)前使用絲-裂霉-素或低血清培養(yǎng)基處理,避免細(xì)胞增殖影響遷移結(jié)果。
數(shù)據(jù)分析
每個實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)置至少三個復(fù)孔,建議每個復(fù)孔記錄多個視野,確保數(shù)據(jù)的嚴(yán)謹(jǐn)性和代表性。
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以上是關(guān)于細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢和局限性、基本步驟及注意事項(xiàng)介紹,更多細(xì)胞培養(yǎng)干貨,請持續(xù)關(guān)注細(xì)胞學(xué)堂專欄~
參考文獻(xiàn)
[1]
Paul CD, Mistriotis P, Konstantopoulos K. Cancer cell motility: lessons from migration in confined spaces [J]. Nature Reviews Cancer. 2017; 17(2):131-140.
[2]
Feng C, Mao W, Yuan C, et al. Nicotine-induced CHRNA5 activation modulates CES1 expression, impacting head and neck squamous cell carcinoma recurrence and metastasis via MEK/ERK pathway [J].Cell Death & Disease. 2024 Oct 29; 15(10):785.
[3]
Vang Mouritzen M, Jenssen H. Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera [J]. Journal of Visualized Experiments Jove. 2018; (138):57691.